BirdsGuide

Авторы использовали для трансплантации ядра клеток, окружающих ооцит, клеток Сертоли из семенников и клеток, выделенных из мозга. Ядра, выделенные из соматических клеток, инъецировали в энуклеированное яйцо с помощью микропипетки. Яйцо активировали к развитию, поместив в специальный раствор , свободный от кальция, и добавляя стронций и цитохалазин. Стронций активировал яйцо, а кальций подавлял образование полярных телец. Эмбрионов культивировали до стадии 2-8 клеток, морулы или бластулы, а затем трансплантировали в матку приёмной матери, где многие из них имплантировались и некоторые из них (15-16%) продолжали своё развитие.

Процент выхода рождённых мышат (их извлекали с помощью кесарева сечения на 18, 19-й дни беременности) был, однако, низок – в разных сериях экспериментов от 2 до 2,8%. Молекулярные исследования доказали принадлежность ядер рождённых мышат к клеткам донора соматических клеток. Таким образом, по крайней мере в некоторых случаях доказана способность ядер соматических клеток обеспечивать нормальное развитие млекопитающих. Но работы с мышами, значительно расширили наши представления о методологии млекопитающих.

Кролики и коровы

Американские исследователи Стек и Робел, используя метод Солитера и Мак Грата, получили шесть живых кроликов, пересадив ядра 8-клеточных эмбрионов одной породы в лишённые ядра яйцеклетки кроликов другой породы. Фенотип родившихся полностью соответствовал фенотипу донора.

Однако только 6 из 164 реконструированных яйцеклеток (3,7%) развились в нормальных животных. Это, конечно, очень низкий выход, практически не позволяющий рассчитывать на получение таким способом клона генетически идентичных животных. Ценность этой работы, тем не менее, в том, что она показала возможность клонирования эмбрионов кроликов.

Работа с реконструированными яйцеклетками крупных домашних животных, коров или овец, идёт несколько по-другому. Их сначала культивируют не «in vitro», а «in vivo» – в перевязанном яйцеводе овцы – промежуточного (первого) реципиента. Затем их оттуда вымывают и трансплантируют в матку окончательного (второго) реципиента – коровы или овцы соответственно, где их развитие происходит до развитого детёныша. Уиландсин предложил заключить реконструированные яйцеклетки в агаровый цилиндр, который он потом трансплантировал в перевязанный яйцевод овцы или коровы. По данным одних авторов реконструированные зародыши лучше развиваются в яйцеводе, чем в культивированной среде, хотя некоторые исследователи получили неплохие результаты и при культивировании «in vitro».

Американцы Робел и его сотрудники использовали щадящий метод извлечения ядра без прокалывания мембраны яйцеклетки, предложенные Мак Гратом и Солитером, пересаживали в зиготы так называемые кариопласты – мужской и женский пронуклеусы вместе с окружающей их цитоплазмой, а также ядра 2-, 4- или 8-клеточных эмбрионов коровы.

Сначала пронуклеусы центрифигурировали, чтобы освободить пронуклеусы от окружающих их гранул желтка, после чего ядра были хорошо видны под микроскопом, что значительно облегчало их удаление. При помощи манипулятора и заострённой стеклянной пипетки извлекали один из бластомеров вместе с ядром из ранних зародышей и переносили его в энуклеированную зиготы

Реконструированные зародыши были заключены в агаровый цилиндр и пересажены в перевязанный яйцевод овцы. Через пять дней культивирования их вымывали, освобождали от агора и исследовали. Реконструированные зародыши в этом случае развивались только в тех случаях, где зиготы в зиготы пересаживали пронуклеусы: 17% таких зародышей достигли стадии морулы или бластулы. Два зародыша были пересажены второму реципиенту – в матку коровы и развитие их завершилось рождением живых телят. Если в качестве доноров использовали ядра 2-, 4- и 8-клеточных зародышей, то реконструированные яйцеклетки не развивались даже до стадии морулы.

Позже были и более успешные работы. Уиландсин, в частности, сообщил, что ему удалось получить четырёх генетически идентичных бычков холстейской породы в результате пересадки в реципиентные яйцеклетки ядер бластул одного 32-клеточного зародыша. Автор утверждал, что большинство ядер сохраняют тотипотентность на 32-клеточной стадии, а значительная их часть 64-клеточной стадии, обеспечивая нормальное развитие реконструированных яйцеклеток до стадии морулы в яйцеводе.